WB اچھی طرح سے کام نہیں کررہا ہے؟ بیہوش یا گمشدہ بینڈ؟ آپ کا نمونہ نکالنے کا طریقہ مسئلہ ہوسکتا ہے!
کولیجن کا استعمال کرتے ہوئے ، جس کو نکالنا مشکل ہے ، مثال کے طور پر ، آئیے ایک ساتھ ڈبلیو بی کے تجربے سے نمٹائیں!
کولیجن ٹھنڈے پانی اور نامیاتی سالوینٹس میں ناقابل تحلیل ہے۔ لہذا ، روایتی ٹشو\/سیل لیسس کے طریقے کولیجن نکالنے کے لئے موثر نہیں ہیں۔ یہاں ، ہم کولیجن کے لئے ہیٹ ایس ڈی ایس نکالنے کا طریقہ استعمال کرنے کی تجویز کرتے ہیں ، جو آسان ، تیز اور انتہائی موثر ہے۔
▇ نمونہ نکالنے کی سفارش - ایس ڈی ایس نکالنے کا طریقہ
1. جانوروں کے نمونے لینے کے لئے ، 5 منٹ کے اندر طریقہ کار کو مکمل کریں۔ بازی کے بعد ، ٹشو کو آہستہ سے کللا کریںپہلے سے ٹھنڈا پی بی ایس (جی 2156)صاف ہونے تک سطح کے خون کو دور کرنا۔ اضافی مائع جذب کرنے کے لئے فلٹر پیپر کا استعمال کریں ، پھر فوری طور پر نمونے کو ایک میں رکھیںای پی ٹیوب یا کریوجینک شیشی (سی وی -3)اور -80 ڈگری پر اسٹور کریں۔ نقل و حمل کے لئے ، نمونے کو جلدی سے a میں منتقل کریںکم درجہ حرارت کا ماحول (خشک برف)تحفظ اور شپنگ کے لئے۔
2. کاٹ a100 ملی گرامٹشو کا نمونہ ٹکڑوں میں اور اسے ایک میں رکھیں2 ملی لٹر پیسنے والی ٹیوب(ht -200- m)۔ شامل کریں10 × حجم (1 ملی لٹر) RIPA (مضبوط) لیسس بفر (G2002)، کے ساتھ پہلے سے ملایاکاک ٹیل (G2006), فاسفوپروٹیز انبیبیٹر (G2007)، اورPMSF (G2008). شامل کریں4 ملی میٹر زرکونیا پیسنے والے موتیوں کے 2 پی سی. چونکہ کولیجن درجہ حرارت سے حساس ہے ، لہذا نکالنے کو انجام دیا جانا چاہئےبرف پر 4 ڈگری پراس کے ٹرپل ہیلکس کو ختم کرنے کی وجہ سے کولیجن انحطاط کو روکنے کے لئے۔
3. پیسنے والی ٹیوب کو اس میں رکھیںکم درجہ حرارت والا ہوموگنائزر (SWE-FP)پروسیسنگ کے لئے. پیسنے والے پیرامیٹرز کو سیٹ کریں4 ڈگری ، 70 ہ ہرٹز ، 60 کی دہائی کے لئے. جلد جیسے سخت نمونوں کے ل multiple ، متعدد بار ہوموجنائزیشن کو دہرائیں20s وقفےزیادہ سے زیادہ نتائج حاصل کرنے کے لئے۔
4. پیسنے کے بعد ، فوری طور پر شامل کریں10 ٪ ایس ڈی ایس حل (جی 2055)حتمی ایس ڈی ایس حراستی کو ایڈجسٹ کرنے کے لئے4%ہوموگانیٹ حجم کی بنیاد پر۔ اچھی طرح سے مکس کریں ، پھر گرمی میں گرم کریں15 منٹ کے لئے 90 ڈگری پر خشک غسل (SMB-H).
5. لائسیٹ پر سینٹرفیوج کریں12 ، 000 RPM کمرے کے درجہ حرارت پر 15 منٹ کے لئے. سپرنٹنٹنٹ جمع کریں ، اس کے لئے ایک حصہ محفوظ کریںبی سی اے پروٹین مقداری پتہ لگانے والی کٹ (جی 2026)پروٹین نکالنے کی کارکردگی کا اندازہ کرنے کے لئے۔
6. پروٹین سپرنٹنٹنٹ کے ساتھ ملا دیں5 × لوڈنگ بفر (G2075)ایک 4: 1 تناسب اور اس سے انکار15 منٹ کے لئے 95 ڈگریایک خشک غسل میں
(اوپر استعمال ہونے والے پروڈکٹ کیٹلاگ نمبر سب سروس بائیو برانڈ سے ہیں۔)
▇ سفارش کردہ تجرباتی شرائط
1. جیل کی تیاری:15- منٹ استعمال کریںایک قدمی فاسٹ کاسٹ رنگین ایکریلیمائڈ کٹ (6 ٪) (G2175).
2. الیکٹروفورسس:استعمال کریںمعیاری الیکٹروفورسس بفر (G2144). اسٹیکنگ جیل کو چلائیں30 منٹ کے لئے 90vجب تک کہ یہ حل کرنے والے جیل میں داخل نہ ہوجائے۔ وولٹیج کو ایڈجسٹ کریں120Vاور الیکٹروفورسس جاری رکھیں جب تک کہ بروموفینول نیلے رنگ کے شیشے کی پلیٹ کے نیچے سے 1 سینٹی میٹر تک نہ پہنچیں ، پھر الیکٹروفورسس کو روکیں۔
3. منتقلی:استعمال کریںفاسٹ ٹرانسفر بفر (G2148)آئس غسل کے بغیر فوری منتقلی کے لئے ،40-60 منٹ کے لئے 300 ایم اے.
4.مسدود کرنا: کے ساتھ بلاک5 ٪ اسکیمڈ دودھ (GC310001)، کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹہ تک انکیوبیٹ کریں۔
5. پرائمری اینٹی باڈی انکیوبیشن:راتوں رات انکیوبیٹ کریں4 ڈگری پر a شیکر (DS -3 D100).
6. ثانوی اینٹی باڈی انکیوبیشن:انکیوبیٹ پرکمرے کا درجہ حرارت a پر شیکر (DS -3 D100)1 گھنٹہ کے لئے۔
7. کیمیلومینیسینس:استعمال کریںای سی ایل کا پتہ لگانے کا ریجنٹ (G2161، مختلف حساسیتوں کے ساتھ ایک مجموعہ سیٹ جس میں تمام پروٹین کی تعداد کم سے اونچائی تک موزوں ہے ، جس سے اوور ایکسپوزر کو کم کیا جاسکتا ہے اور کامیابی کی شرحوں میں بہتری آتی ہے)۔
8. کیمیلومینیسینس امیجنگ:کیمیلومینیسینس امیجنگ انجام دیں (SCG-W3000تجویز کی جاتی ہے ، ایک نمائش میں کمزور اور مضبوط سگنل دونوں کو بے نقاب کرنے کے قابل)۔
(اوپر استعمال ہونے والے پروڈکٹ کیٹلاگ نمبر سب سروس بائیو برانڈ سے ہیں۔)
ایس ڈی ایس نکالنے کے طریقہ کار کا موازنہ بمقابلہ معیاری نکالنے کے طریقہ کار کے نتائج
1. بلی. نہیں: GB114197
لین 1: ماؤس جلد کے ٹشو لیسیٹ
پیش گوئی شدہ بینڈ کا سائز: 139 کے ڈی اے
لین 2: ماؤس جلد کے ٹشو لیسیٹ (ایس ڈی ایس نکالنے کا طریقہ)
پتہ چلا بینڈ کا سائز: 120-140 KDa
لین 3: چوہا جلد کے ٹشو لیزیٹ
لین 4: چوہا جلد کے ٹشو لیسیٹ (ایس ڈی ایس نکالنے کا طریقہ)
ایس ڈی ایس نکالنے کے طریقہ کار کا موازنہ بمقابلہ معیاری نکالنے کے طریقہ کار کے نتائج
2. بلی. نہیں: GB11022
لین 1: ماؤس جلد کے ٹشو لیسیٹ (RIPA نکالنے کا طریقہ)
لین 2: چوہا جلد کے ٹشو لیسیٹ (RIPA نکالنے کا طریقہ)
لین 3: ماؤس جلد کے ٹشو لیسیٹ (ایس ڈی ایس نکالنے کا طریقہ)
لین 4: چوہا جلد کے ٹشو لیسیٹ (ایس ڈی ایس نکالنے کا طریقہ)
ڈبلیو بی کے تجربات کے ل Load کنٹرول اینٹی باڈیز لوڈنگ ضروری ہیں۔
