2×ان فیوژن کلوننگ مکس

 

پروڈکٹ کا نام	بلی نہیں	سپیک
2×ان فیوژن کلوننگ مکس	G3350-20T	20 T
	G3350-100T	100 T

 

 

2×اِن-فیوژن کلوننگ مکس کو کسی بھی ویکٹر میں DNA کے ایک یا 2~3 متعدد ٹکڑوں کی تیز، دشاتمک کلوننگ کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے، خاص طور پر سنگل فریگمنٹ کے لیے موزوں ہے۔ یہ ڈی این اے کے ٹکڑوں کو فیوز کرتا ہے (مثلاً پی سی آر سے تیار کردہ انسرٹس اور لکیری ویکٹرز) کو ان کے سروں پر 15-بی پی اوورلیپس کو پہچان کر موثر اور درست طریقے سے۔ ان 15-بی پی اوورلیپس کو مطلوبہ ترتیب کو بڑھانے کے لیے پرائمر ڈیزائن کر کے انجنیئر کیا جا سکتا ہے۔

پریمکس لیگیس سسٹم پر منحصر نہیں ہے، جو ویکٹر سیلف-لگیشن کے پس منظر کو بہت حد تک کم کر دیتا ہے، اور اسے داخل کردہ ٹکڑے میں موجود پابندی endonuclease سائٹ پر غور کرنے کی ضرورت نہیں ہے۔ ویکٹر میں سنگل فریگمنٹ کلوننگ کے لیے، مثبت کلون کا تناسب زیادہ سے زیادہ 99% تک حاصل ہوا۔ مکس کے ساتھ، ڈی این اے کے نمونے کی تیاری سے لے کر پلیٹ تبدیل شدہ خلیات تک تمام آپریشنز تھرموسٹیٹ آلات کے بغیر چند گھنٹوں میں مکمل کیے جا سکتے ہیں۔

 

 

گیلی برف کے ساتھ جہاز؛ -20 ڈگری پر اسٹور، 12 ماہ کے لیے درست۔

 

 

جزو	G3350-20T	G3350-100T
2×ان فیوژن کلوننگ مکس	100 μL	5×100 μL
پی یو سی 19 (لینیرائزڈ٪ 2c کنٹرول ویکٹر٪2c 5 ng٪2f٪ce٪bcL)	10 μL	10 μL
کنٹرول داخل کریں (10 ng/μL)	10 μL	10 μL
دستی	ایک کاپی

 

 

ligation ردعمل انجام دیں

1. ایک آٹوکلیوڈ، 15- ملی لیٹر مائکرو سینٹرفیوج ٹیوب میں، درج ذیل شامل کریں

جزو	حجم
2×ان فیوژن کلوننگ مکس	5 μL
ویکٹر ڈی این اے	X μL
ڈی این اے داخل کریں۔	Y μL
نیوکلیز سے پاک پانی	10 μL میں شامل کریں۔

2. مواد کو ٹیوب کے نیچے تک لانے کے لیے آہستہ سے مکس کریں اور سنٹری فیوج کو مختصر کریں۔

3. برف کے پانی کے غسل (برف کے پانی کے مرکب) میں 5 - 10 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔

4. ٹیوب کو برف پر رکھیں اور تبدیلی کے رد عمل کو انجام دینے کے لیے فوری طور پر آگے بڑھیں۔ یا آپ ligation کے مرکب کو -20 ڈگری پر ذخیرہ کر سکتے ہیں جب تک کہ آپ تیار نہ ہوں۔

تبدیلی کے رد عمل کو انجام دیں۔

5. کیمیاوی طور پر قابل خلیات (جیسے E.coli DH5، E.coli Top10، وغیرہ) میں مناسب ligation مکسچر شامل کریں اور آہستہ سے تھپتھپا کر مکس کریں۔ اوپر نیچے پائپ لگا کر مکس نہ کریں۔ باقی ligation کے مرکب کو −20 ڈگری پر ذخیرہ کیا جا سکتا ہے۔

5. برف پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔

6. 42 ڈگری پانی کے غسل میں بالکل 90 سیکنڈ تک انکیوبیٹ کریں۔ مکس نہ کریں اور نہ ہلائیں۔

7. سینٹری فیوج ٹیوبوں کو 42 ڈگری غسل سے ہٹائیں اور انہیں برف پر 2-5 منٹ کے لیے رکھیں۔

8. 900 µL SOC یا LB میڈیم شامل کریں۔ آلودگی سے بچنے کے لیے جراثیم سے پاک تکنیک کا استعمال کیا جانا چاہیے۔ سنٹری فیوج ٹیوب کو ہلاتے ہوئے انکیوبیٹر میں 225 rpm پر 1 گھنٹے کے لیے 37 ڈگری پر ہلائیں۔

9. ہر ٹرانسفارمیشن سینٹری فیوج ٹیوب سے مناسب حجم کو الگ، لیبل والی LB آگر پلیٹوں پر پھیلائیں۔ بقیہ ٹرانسفارمیشن مکس کو 4 ڈگری پر ذخیرہ کیا جا سکتا ہے اور اگر چاہیں تو اگلے دن چڑھایا جا سکتا ہے۔

10. پلیٹ کو الٹ دیں اور رات بھر 37 ڈگری پر انکیوبیٹ کریں۔

ٹرانسفارمینٹس کا تجزیہ کریں۔

11. کالونیوں کو منتخب کریں اور پلازمڈ تنہائی، پی سی آر، یا ترتیب کے ذریعے تجزیہ کریں۔

 

 

1. ویکٹر ڈی این اے اور انسرٹ ڈی این اے کو جیل صاف کیا جانا چاہئے اور الیکٹروفورسس کے ذریعہ ان کے معیار اور ارتکاز کا تجزیہ کرنا چاہئے۔ اگر ارتکاز کم ہو تو ligation کے رد عمل میں پانی کو چھوڑا جا سکتا ہے۔

2. The Tm value between the overlapping regions of multiple fragments should be consistent and >60 ڈگری

3. یہ سفارش کی جاتی ہے کہ ویکٹر اور انسرٹ کا داڑھ کا تناسب 1:1~1:3 ہے؛ جب 2-3 ٹکڑے آپس میں جڑے ہوتے ہیں، تو ہر ٹکڑے کے درمیان داڑھ کا تناسب 1:1 ہوتا ہے، اور ligation ری ایکشن سسٹم کو مساوی تناسب میں بڑھایا جا سکتا ہے۔

4. اگر ویکٹر اور انسرٹ کا کل حجم 5 μL سے زیادہ ہے، تو آپ ligation سسٹم کو 20 μL تک پیمانہ کر سکتے ہیں۔

5. ligation پروڈکٹ کا حجم قابل خلیات کے حجم کے 1/10 سے زیادہ نہیں ہونا چاہئے، ورنہ تبدیلی کی کارکردگی نمایاں طور پر کم ہو جائے گی۔ ligation پراڈکٹ اور قابل خلیات کا حجم مساوی تناسب میں بڑھایا جا سکتا ہے (مثال کے طور پر، 20 μL ligation system 200 μL قابل خلیوں کو تبدیل کرتا ہے)۔

6. 2×یونیورسل لیگیشن مکس کو استعمال کے 5-10 منٹ کے اندر تک -20 ڈگری پر رکھا جانا چاہیے اور استعمال کے بعد فوراً -20 ڈگری پر واپس آ جانا چاہیے۔ منجمد پگھلنے کے چکر کو کم کرنے کے لیے ایلی کوٹ میں منجمد کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔

7. اگر الیکٹروپوریشن کو تبدیلی کے لیے استعمال کیا جاتا ہے تو، ویکٹر ڈی این اے اور انسرٹ ڈی این اے کو کالم طریقہ یا ایتھنول ورن کے طریقہ سے پاک کیا جانا چاہیے۔

 

 

صرف تحقیقی استعمال کے لیے!

 

 

ڈاؤن لوڈ، اتارنا ٹیگ: 2×ان-فیوژن کلوننگ مکس، چین 2×ان-فیوژن کلوننگ مکس مینوفیکچررز، سپلائرز، فیکٹری