Hygromycin B (50 Mg/mL)

Hygromycin B ایک امینوگلیکوسائیڈ اینٹی بائیوٹک ہے جو Streptomyces suis کے میٹابولزم سے تیار ہوتی ہے۔ Hygromycin B 70S ribosomal translocations میں مداخلت کرکے اور mRNA ٹیمپلیٹس کی غلط پڑھائی کو اکسا کر اور اس طرح پروٹین کی ترکیب کو روک کر پروکاریوٹک (بیکٹیریا)، یوکرائیوٹک (مثلاً، خمیر، فنگس) اور اعلیٰ ممالیہ یوکرائیوٹک خلیات کو مار ڈالتا ہے۔

E. کولی سے ماخوذ ہائگرومائسن مزاحمتی جین (hyg یا hph)، جو hygromycin B فاسفوٹرانسفریز کو انکوڈ کرتے ہیں، ہائگرومائسن B کو حیاتیاتی طور پر غیر فعال فاسفوریلیٹڈ پروڈکٹ میں تبدیل کرکے اسے detoxify کرتے ہیں۔ اس اصول کے جواب میں، hygromycin B ایک بہت ہی مفید مزاحمتی انتخابی نشان ہے جو کہ کلچر پروکاریوٹک یا یوکرائیوٹک خلیات کی اسکریننگ اور برقرار رکھنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے جو کامیابی کے ساتھ ہائگرومائسن مزاحمتی جینوں سے منتقل ہو چکے ہیں۔ اس کے علاوہ، یہ اکثر G418 کے ساتھ مل کر استعمال کیا جاتا ہے کیونکہ عمل کے انداز میں فرق کی وجہ سے دوہری مزاحمتی-مثبت سیل لائنوں کے انتخاب کے لیے۔

یہ پروڈکٹ ہائگرومائسن B (50 mg/mL) کا جراثیم سے پاک محلول ہے، جسے استعمال کے لیے کلچر میڈیم سے براہ راست پتلا کیا جا سکتا ہے۔ عام طور پر استعمال شدہ کام کرنے کا ارتکاز 200-500 ug/mL ہے۔ تجرباتی نظاموں میں پہلی بار استعمال کرنے کے لیے، خوراک کے جواب کے منحنی خطوط کو قائم کرکے اسکریننگ کے بہترین ارتکاز کا تعین کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔

گیلی برف کے ساتھ جہاز۔ 24 ماہ کے لیے 2-8 ڈگری پر اسٹور کریں۔

1. ہائگرومائسن بی کے لیے خوراک کے ردعمل کے وکر کا تعین:

پہلی بار استعمال ہونے والے خلیات کے لیے، عام طور پر تجرباتی طور پر ایک خوراک کے جواب کے منحنی خطوط کا تعین کرنا ضروری ہوتا ہے جو آپ کے تجرباتی نظام کے لیے موزوں ہو۔

1) دن 1: 24-کنویں کی پلیٹوں کو 5~8×10 کی کثافت پر غیر منتقلی خلیوں کے ساتھ ٹیکہ لگایا گیا تھا۔⁴خلیات/کنواں، بعد میں خوراک کے تدریجی تجربات کے لیے کافی تعداد میں کنوؤں کا ٹیکہ لگانا۔ سیل کلچر انکیوبیٹر میں سیلوں کو راتوں رات کلچر کیا جاتا تھا۔

2) دن 2: راتوں رات انکیوبیشن کے بعد خلیوں کو تازہ تیار کردہ اسکریننگ میڈیم کے ساتھ تبدیل کریں جس میں ہائگرومائسن B کی مختلف مقداریں ہوں (جیسے 0, 50, 100, 250, 500, 750, 1000 ug/mL، وغیرہ)، اور میڈیم کو تبدیل کرنے کے بعد سیل کلچر انکیوبیٹر میں انکیوبیشن جاری رکھیں۔ اس کے بعد، میڈیم کو ہر 3-4 دن بعد تازہ اینٹی بائیوٹک پر مشتمل میڈیم سے تبدیل کیا گیا۔

3) غیر منتقلی خلیوں کی نشوونما کو روکنے کے لیے مناسب ارتکاز کا تعین کرنے کے لیے لائیو خلیوں کی گنتی مقررہ وقفوں پر انجام دی گئی، اور سب سے کم ارتکاز جس نے خلیوں کی اکثریت کو 7-10 دنوں میں ہلاک کر دیا اسے مستحکم طور پر اسکریننگ کے لیے کام کرنے والے ارتکاز کے طور پر منتخب کیا گیا۔ منتقلی خلیات.

2. مستحکم طور پر منتقل شدہ خلیوں کی اسکریننگ:

مزاحمتی جین پر مشتمل پلازمڈ کی منتقلی کے بعد یا جین پر مشتمل وائرس کے انفیکشن کے بعد مستحکم اظہار کے تناؤ کی جانچ کی جاسکتی ہے۔

1) خلیات کو 48 گھنٹے تک منتقلی یا انفیکٹ کیا گیا، اور پھر تازہ میڈیم میں کلچر کیا گیا جس میں ہائیگرومائسن بی کی مناسب حراستی تھی۔

نوٹ: اینٹی بائیوٹک اثر سب سے زیادہ اس وقت ظاہر ہوتا ہے جب خلیات تقسیم کے فعال مرحلے میں ہوں۔ اگر خلیے بہت گھنے ہوں گے تو اینٹی بائیوٹک کی تاثیر نمایاں طور پر کم ہو جائے گی، اس لیے بہتر ہے کہ خلیات کی کثافت 25% سے زیادہ نہ رکھی جائے۔ ایک ہی وقت میں عام خلیوں کا ایک کنٹرول گروپ بنانے کی سفارش کی جاتی ہے۔ منتقلی یا انفیکشن کے 48 گھنٹے کے بعد، اگر خلیے بہت گھنے ہوں تو آپ ہضم ہونے کے بعد خلیوں کو دوبارہ ٹیکہ لگا سکتے ہیں اور ہائگرومائسن بی اسکریننگ کے لیے راتوں رات انکیوبیٹ کر سکتے ہیں۔

2) ہر 3-4 دن بعد میڈیم کو اینٹی بائیوٹک پر مشتمل تازہ میڈیم سے بدل دیں۔

3) اسکریننگ کے 7 دنوں کے بعد، کنٹرول گروپ میں 100% عام خلیات مردہ ہو جائیں، اور منتقلی گروپ میں زندہ بچ جانے والے خلیے وہ ہیں جو ہائگرومائسن بی مزاحمتی جین کا اظہار کرتے ہیں۔ پھر تجرباتی مقصد کے مطابق پولی کلونل یا مونوکلونل سیل کے لیے اسکرین کریں۔

4) منتخب مستحکم مزاحم کلون کو اسکریننگ میڈیم میں 7-10 دنوں تک برقرار رکھا جاتا رہا، جس کے بعد عام میڈیم کو آسانی سے بدل دیا گیا۔

صرف تحقیقی استعمال کے لیے! تشخیصی طریقہ کار میں استعمال کے لیے نہیں!

Ver نمبر:V1.0-202301

ڈاؤن لوڈ، اتارنا ٹیگ: hygromycin b（50 mg/ml）, China hygromycin b（50 mg/ml） مینوفیکچررز، سپلائرز، فیکٹری