امیونوپریسیپیٹیشن کٹ (پروٹین اے ایگرز)

 

پروڈکٹ کا نام	بلی نہیں	سپیک
امیونوپریسیپیٹیشن کٹ (پروٹین اے ایگرز)	G2215-50T	50 T

 

 

IP یا Co-IP مخصوص اینٹی باڈیز اور ایک میڈیم جو اینٹی باڈیز (مثلاً Protein A/G Agarose یا Protein A/G Magrose) کا استعمال کرتے ہوئے، یا براہ راست استعمال کرتے ہوئے پروٹین یا پروٹین-پروٹین کے تعاملات (PPIs) کا مطالعہ کرنے کے لیے ایک عام تجرباتی تکنیک ہے۔ میڈیم کو مخصوص اینٹی باڈیز (مثلاً ایگروز یا مقناطیسی موتیوں) کے ساتھ مل کر، اور پھر پیچیدہ پروٹین کے نمونوں سے اینٹیجن اینٹی باڈی کمپلیکس کو الگ کر کے سینٹرفیوگریشن یا مقناطیسی قوت، تاکہ ہدف کے پروٹینوں کو الگ تھلگ اور صاف کرنے کے مقصد کو حاصل کیا جا سکے، جو بعد میں مغربی دھبے یا ماس اسپیکٹومیٹری کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ پروٹین A سیل کی دیوار کی سطح کا پروٹین ہے جو Staphylococcus aureus میں پایا جاتا ہے جس کا مالیکیولر وزن 42 kDa ہے۔ پروٹین جی ایک امیونوگلوبلین بائنڈنگ پروٹین ہے جس کا اظہار Streptococcal بیکٹیریا قسم C یا G سے ہوتا ہے۔ پروٹین A اور Protein G عملی طور پر ایک جیسے ہوتے ہیں اور خاص طور پر ممالیہ امیونوگلوبلین (Ig) سے جڑ سکتے ہیں۔ ریکومبیننٹ پروٹین A اور G کو مناسب ترمیم کے ساتھ agarose کے ساتھ پابند کیا جا سکتا ہے امیونوپریسیپیٹیشن یا اینٹی باڈی صاف کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ پروٹین A agarose انسانی IgG1، IgG2، IgG4، ماؤس IgG2a، IgG2b کے مدافعتی عمل کے لیے موزوں ہیں، جب کہ پروٹین G ایگرز موتیوں کی مالا انسانی IgG1، IgG2، IgG3، IgG4، ماؤس IgG2، IgG2، IgG2، IgG2، IgG2، IgG2، IgG2، IgG2، IgG2، IgG3، IgG2، IgG3، IgG2، IgG3، IgG2، IgG3، IgG4، IgG2، IgG3، IgG4، IgG2، IgG2b کے مدافعتی عمل کے لیے موزوں ہیں۔ چوہا IgG1، IgG2a، IgG2b، IgG2c پولی کلونل اینٹی باڈیز۔ (مخصوص معلومات کے لیے جدول I دیکھیں)

یہ پروڈکٹ خود تیار شدہ اور تیار کردہ پروٹین A لیبل لگا ہوا ایگروز کو اپناتی ہے، مارکیٹ میں اسی طرح کی مصنوعات کے مقابلے میں، یہ پروڈکٹ اینٹی باڈیز کو زیادہ موثر طریقے سے باندھتی ہے اور اس کی غیر مخصوص بائنڈنگ کی شرح کم ہے، اس کے ساتھ آپٹمائزڈ بفر کے ساتھ، یہ آسان اور موثر ہو سکتا ہے۔ امیونوپریسیپیٹیشن تجربات کے لیے؛ یہ بڑے پیمانے پر سیل لائسیٹس، سیلولر سیکریشن سپرنٹنٹس، سیرم، جلودر وغیرہ جیسے نمونوں میں ہدف پروٹین کی تنہائی اور تطہیر میں استعمال کیا جا سکتا ہے۔ یہ کٹ ٹارگٹ پروٹین کو ایلوٹ کرنے کے لیے دو ایلوشن طریقے (ڈینیچرنگ ایلیوشن اور ایسڈ ایلیوشن) فراہم کرتی ہے، خاص طور پر ایسڈ ایلیوشن میں اینٹی باڈی کی ہلکی اور بھاری زنجیریں نہیں ہوں گی، جو اینٹی باڈی کے بھاری اور ہلکے مداخلت کے مسئلے کو مؤثر طریقے سے حل کر سکتی ہیں۔ امیونوپریسیپیٹیشن اور پروٹین امیونوبلوٹنگ تجربات میں زنجیریں۔

 

 

خصوصیات	تفصیل
پروڈکٹ کا مواد	مخصوص حفاظتی بفر میں 50%(v/v) اگروز
موتیوں کی ساخت	6% کراس لنکڈ ایگروز
جوڑے پروٹین	پروٹین اے
پروٹین کی میگاواٹ	~25 kDa (پروٹین اے)
بائنڈنگ پروٹین کی گنجائش	>1 ملی گرام ماؤس اینٹی باڈی فی ملی لیٹر موتیوں کی مالا
خاصیت	مختلف پرجاتیوں سے اینٹی باڈیز، بشمول چوہے، انسان، چوہے، بکری، بھیڑ اور مویشی
مالا قطر	30~150 μm
اخراج کے طریقے	تیزاب کے ساتھ الیوشن، یا 1x SDS-PAGE لوڈنگ بفر (کم کیا گیا) نوٹ: اگر 1x SDS-PAGE لوڈنگ بفر (کم کر دیا گیا ہے)، اینٹی باڈی کی بھاری زنجیر (~ 50kDa) اور ہلکی زنجیر (~ 25kDa) کو ڈینیچر کر دیا جائے گا اور ایگرز موتیوں سے جاری کیا جائے گا۔
ایپلی کیشنز	IP، Co-IP، پروٹین صاف کرنا

 

 

گیلی برف کے ساتھ جہاز؛ 5×SDS-PAGE لوڈنگ بفر (کم کیا ہوا) 12 ماہ کے لیے -20 ڈگری پر اور دوسرے کو 2-8 ڈگری پر اسٹور کیا جانا چاہیے۔

 

 

اجزاء نمبر	جزو	G2215-50T	اسٹوریج کا درجہ حرارت
G2038	آئی پی لیسس بفر	50 ملی لیٹر	2-8 ڈگری
G0015	10×TBS	5 ملی لیٹر	2-8 ڈگری
G2215-1	SweAgarose پروٹین A	1 ملی لیٹر	2-8 ڈگری
G2215-2	ایسڈ ایلیوشن بفر	10 ملی لیٹر	2-8 ڈگری
G2215-3	Neulization Elution Buffer	1 ملی لیٹر	2-8 ڈگری
G2013	5x SDS-PAGE لوڈنگ بفر (کم کیا گیا)	1 ملی لیٹر	-20 ڈگری
دستی		1 پی سی

 

 

پروڈکٹ کا نام	بلی نمبر	سپیک
50 × کاک ٹیل پروٹیز روکنے والا	G2006-250UL	250 μL
PBS,1×(فاسفیٹ بفرڈ نمکین)	G4202-500ML	500 ملی لیٹر

 

 

1. کٹ کی تیاری

a) نیچے دیے گئے جدول سے رجوع کریں، متعلقہ ریجنٹس کو فی نمونہ lysate کے 100-500 μL کے تناسب سے تیار کریں۔

قدم	حل درکار ہے۔	حجم	حجم
سیل لیسس اور تیاری	آئی پی لیسیٹ جس میں کاک ٹیل پروٹیز روکنا ہے۔	100 μL	500 μL
آئی پی	SweAgarose پروٹین A	4 μL	20 μL
تین بار دھوئے۔	1×TBS	100 μL	500μL
ایسڈ ایلیوشن اور نیوٹرلائزیشن	ایسڈ ایلیوشن بفر	20 μL	100 μL
	نیوٹرلائزیشن بفر	20 μL	100 μL
Denaturing Elution	1x SDS-PAGE لوڈنگ بفر (کم کیا گیا)	20 μL	100 μL

 

b) پروٹیز انحیبیٹر پر مشتمل آئی پی لیسیٹ کی تیاری: اوپر دیے گئے جدول کو دیکھیں، lysis کے لیے {{{0}} μL IP lysate کا استعمال کریں جس میں protease inhibitor فی 0۔{2}} ملین سیل؛ IP lysate کو 50x Cocktail protease inhibitor (G2006-250UL کی سفارش کی جاتی ہے) کے ساتھ 50:1 کے تناسب سے مکس کریں، مثال کے طور پر، 50x Cocktail protease inhibitor کے 20 μL کو 1 mL IP lysate میں شامل کریں، پھر 1 mL پروٹیز روکنے والے پر مشتمل IP lysate حاصل کیا جائے گا؛ تیار شدہ آئی پی لائسیٹ جس میں روکنا ہے اسے برف کے غسل میں یا 4 ڈگری پر رکھا جانا چاہیے۔

c) نوٹ: اگر امیونوپریسیپیٹیشن کے ٹارگٹ پروٹین میں فاسفوریلیشن یا ایسٹیلیشن ترمیم شامل ہے تو فاسفیٹیس انحیبیٹر یا ڈیسیٹیلیز انابیٹر کو شامل کیا جانا چاہئے (خود فراہم کردہ)؛ روکنے والے پر مشتمل آئی پی لائسیٹ کو استعمال سے پہلے تیار کیا جانا چاہئے، اور اسے منجمد نہیں کیا جانا چاہئے اور بعد میں استعمال کے لئے برقرار رکھنا چاہئے۔

d) 1×TBS کی تیاری: 10×TBS بفر کو انتہائی خالص پانی کے ساتھ 1×TBS تک پتلا کریں۔ مثال کے طور پر، 10×TBS بفر کا 1 mL 9 mL انتہائی خالص پانی میں شامل کریں، جو کہ اچھی طرح مکس کرنے کے بعد 1×TBS بفر ہے۔

e) 1x SDS-PAGE لوڈنگ بفر کی تیاری (کم کیا گیا): 1x SDS-PAGE لوڈنگ بفر بنانے کے لیے 5x SDS-PAGE لوڈنگ بفر (کم کیا گیا) کو 5 بار انتہائی خالص پانی سے پتلا کیا گیا (کم کیا گیا)؛ مثال کے طور پر، 5x پروٹین بفر (کم شدہ) کے 0.2mL کو 0.8 ملی لیٹر انتہائی خالص پانی کے ساتھ مکس کریں، جو کہ 1x SDS-PAGE لوڈنگ بفر (کم کیا ہوا) ہے۔

2. اینٹیجن کے نمونے کی تیاری

امیونوپریسیپیٹیشن یا امیونوپریسیپیٹیشن کے تجربات نمونے ڈالے جانے کے فوراً بعد کیے جانے چاہئیں، اگر نہیں تو نمونوں کو ریفریجریٹر میں -20 ڈگری یا -80 ڈگری پر ذخیرہ کیا جا سکتا ہے، لیکن جمنا اور پگھلنا پروٹین-پروٹین کے تعامل کو متاثر کر سکتا ہے۔ پروٹین کے انحطاط کو کم سے کم کرنے کے لیے نمونے کے تمام مراحل کو برف کے غسل میں یا 4 ڈگری پر چلایا جانا چاہیے، اور نمونے کی ایک خاص مقدار کو ان پٹ یا ٹوٹل کے طور پر لیا جانا چاہیے جب نمونہ بعد میں پتہ لگانے کے لیے تیار کیا جائے۔ مغربی دھبہ۔

ٹشو کے نمونوں کے لیے:

a) اضافی خون کو اچھی طرح سے نکالنے کے لیے ٹشوز کو پری کولڈ PBS (G4202 تجویز کردہ) میں دھونا چاہیے۔ برف پر ہوموجنائزر میں تول کر چھوٹے چھوٹے ٹکڑوں میں کاٹ لیں۔

ب) ٹشو کے 100-200 μL فی 10-20 ملی گرام کے تناسب سے پروٹیز انحیبیٹر پر مشتمل IP lysate شامل کریں، یا اگر پروٹین کی زیادہ مقدار کی ضرورت ہو تو IP lysate کی مقدار کو کم کریں۔

c) شیشے کے ہوموجینائزر یا ہینڈ ہیلڈ ہوموجینائزر کے ساتھ ہوموجینائز کریں، یا مکمل پیسنے کے لیے ہمارے خود تیار کردہ KZ-III-F کم درجہ حرارت کی چکی کا استعمال کریں۔

d) ہوموجنیٹ کو 1.5 ملی لیٹر سینٹرفیوج ٹیوب میں منتقل کیا گیا، ہلایا اور ملایا گیا، اور 30 ​​منٹ کے لیے برف سے نہایا گیا، ٹشو سیلز کے مکمل لیسز کو یقینی بنانے کے لیے ہر 10 منٹ پر ایک پپیٹ کے ساتھ پھونکا دہرایا گیا۔

e) 12،000 xg پر 4 ڈگری پر 5 منٹ کے لیے سینٹری فیوج، بعد میں امیونوپریسیپیٹیشن یا امیونوپریسیپیٹیشن تجربات کے لیے پریسیپیٹیٹ اور ایسپیریٹ سپرنٹنٹ کو ضائع کریں۔

پیروکار سیل کے نمونوں کے لیے:

a) اگر ضروری ہو تو، خلیات کو PBS کے ساتھ 2-3 بار دھویا جا سکتا ہے، آخری وقت میں بقیہ مائع کو اچھی طرح جذب کریں۔

ب) خلیات کو سیل سکریپر سے کھرچیں یا ٹرپسن ہضم کریں تاکہ خلیوں کو مکمل طور پر معطل کیا جا سکے، انہیں 1.5 ملی لیٹر سینٹری فیوج ٹیوب میں جمع کریں اور 1،000 xg پر 5 منٹ کے لیے 4 ڈگری پر، سپرنٹنٹ کو ضائع کر دیں۔ سیل پرسیپیٹیٹ جمع کریں۔

c) {{0}} μL IP lysate کا شامل کریں جس میں پروٹیز inhibitor فی 0۔{2}} ملین خلیات (ایک 6-کنویں پلیٹ کے ایک کنویں کے برابر)؛ خلیات کو مکمل طور پر لیس کرنے کے لیے مناسب طریقے سے پھونک ماریں اور 3-5 منٹ تک برف سے غسل کریں، اور مکمل طور پر لیس ہونے کے بعد کوئی واضح سیلولر بارش نہیں ہونی چاہیے۔ اگر خلیات کی مقدار زیادہ ہے، تو یہ تجویز کی جاتی ہے کہ خلیوں کو 0 میں تقسیم کیا جائے۔

d) کافی lysis کے بعد، 12،000 xg پر 5 منٹ کے لیے 4 ڈگری پر سینٹری فیوج کریں، بعد میں امیونوپریسیپیٹیشن یا امیونوپریسیپیٹیشن تجربات کے لیے پریسیپیٹیٹ اور ایسپیریٹ سپرنٹنٹ کو ضائع کریں۔

سیل کے نمونے معطل کرنے کے لیے:

a) 1،000 xg پر 5 منٹ کے لیے 4 ڈگری پر سنٹری فیوج کو جمع کرنے کے لیے؛ اگر ضروری ہو تو، پی بی ایس کے ساتھ ایک بار دھوئیں، پھر بقایا مائع اور آہستہ سے بھنور کو زیادہ سے زیادہ خلیات کو منتشر کرنے کے لیے اسپیریٹ کریں۔

b) {{0}} μL IP lysate شامل کریں جس میں پروٹیز انحیبیٹر فی 0 شامل ہو۔{2}} ملین سیل (ایک کنویں کے برابر ایک 6-کنویں پلیٹ)؛ خلیات کو مکمل طور پر لیس کرنے کے لیے مناسب طریقے سے پھونک ماریں اور 3-5 منٹ تک برف سے غسل کریں۔ اگر خلیات کی مقدار زیادہ ہے، تو یہ تجویز کی جاتی ہے کہ خلیوں کو 0 میں تقسیم کیا جائے۔

c) 5 منٹ کے لیے برف کا غسل، 5 منٹ کے لیے 12000 گرام 4 ڈگری پر سینٹرفیوگریشن، سپرناٹینٹ لیں، یعنی کل پروٹین محلول، جسے بعد میں امیونوپریسیپیٹیشن یا امیونوپریسیپیٹیشن تجربات وغیرہ کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔

بیکٹیریل یا خمیر کے نمونوں کے لیے:

a) 1 ملی لیٹر بیکٹیریل یا خمیر کا محلول لیں اور سپرناٹینٹ کو دور کرنے کے لیے سینٹری فیوج لیں۔ اگر ضروری ہو تو، خلیوں کو پی بی ایس کے ساتھ ایک بار دھویا جا سکتا ہے، آخری وقت میں بقایا مائع کو اچھی طرح سے جذب کریں. جہاں تک ممکن ہو خلیات کو منتشر کرنے کے لیے ٹیوب کے نچلے حصے کو ہلکے سے بھنور یا جھٹکا دیں۔

b) پروٹیز انحیبیٹر پر مشتمل IP lysate کا 100-200 μL شامل کریں اور بیکٹیریا یا فنگس کو مکمل طور پر منتشر کرنے کے لیے آہستہ سے پھونک دیں۔

c) 10 منٹ کے لیے برف کا غسل، بہتر lysis کے لیے، بیکٹیریا اور خمیر کو بالترتیب لائزوزائیم اور وال بریکنگ انزائم (خود فراہم کردہ) کے ساتھ ہضم کیا جا سکتا ہے، اور پھر پروٹیز انحیبیٹرز پر مشتمل IP lysate کے ساتھ لیس کیا جا سکتا ہے۔

d) 4 ڈگری پر 5 منٹ کے لیے 12،000 xg پر سینٹری فیوج، بعد میں امیونوپریسیپیٹیشن یا امیونوپریسیپیٹیشن کے تجربات کے لیے پریسیپیٹیٹ اور ایسپیریٹ سپرنٹنٹ کو ضائع کریں۔

3. آگروز کی تیاری

a) SweAgarose Protein A موتیوں کو نرمی سے دوبارہ معطل کریں تاکہ زیادہ سے زیادہ یکساں موتیوں کی بازی بنائیں، ہر 500 ul نمونے کے لیے 20 ul اچھی طرح سے ملا ہوا مالا کا پھیلاؤ شامل کریں، مناسب مقدار میں agarose موتیوں کو EP ٹیوب کو صاف کریں اور 0.5 ملی لیٹر کے آخری حجم میں 1x TBS شامل کریں ہر ایک نمونے کے لیے ایک مثال کے طور پر درج ذیل امیونوپریسیپیٹیشن مراحل میں استعمال کیا جاتا ہے)۔

ب) موتیوں کو آہستہ سے دوبارہ لگائیں، سنٹری فیوج 6،000×g کے لیے 30 سیکنڈ کے لیے 4 ڈگری پر، احتیاط سے سپرنٹنٹ کو ہٹا دیں اور مندرجہ بالا مراحل کو دو بار دہرائیں۔

c) موتیوں کو 1x TBS کے ساتھ ابتدائی مالا کی بازی کے حجم کے مطابق دوبارہ معطل کیا گیا تھا۔

4. اینٹی باڈی SweAgarose پروٹین A موتیوں کا پابند ہے۔

a) اینٹی باڈی کی تیاری: اینٹی باڈی کو 1x TBS کے ساتھ پتلا کریں تاکہ اینٹی باڈی ہدایات میں تجویز کردہ ڈائلیشن ریشو کے مطابق اینٹی باڈی ورکنگ سلوشن تیار کیا جا سکے، یا اینٹی باڈی کو 5-50 ug/mL کے حتمی ارتکاز کے ساتھ اینٹی باڈی ورکنگ سلوشن میں تیار کریں۔ , جو برف پر تیار کیا جا سکتا ہے؛ اختیاری: ایک ہی اینٹی باڈی پرجاتیوں کے نارمل IgG کا استعمال کریں تاکہ عام IgG کام کرنے والے محلول کو اسی کم کرنے کے تناسب یا 5-50 ug/mL کے حتمی ارتکاز کے ساتھ تیار کریں، غیر مخصوص بائنڈنگ کو ہٹائیں یا منفی کنٹرول کے طور پر کام کریں۔ ایک ہی نوع کے عام آئی جی جی کا مطلب یہ ہے کہ اگر بعد میں امیونوپریسیپیٹیشن میں استعمال ہونے والا اینٹی باڈی ماؤس آئی جی جی ہے تو اس مرحلے میں عام ماؤس آئی جی جی کی مناسب مقدار کو 1x ٹی بی ایس کے ساتھ کم کیا جا سکتا ہے تاکہ پس منظر کو کم کیا جا سکے یا منفی کنٹرول کے طور پر۔

ب) اینٹی باڈی جذب: مرحلہ 3 میں تیار کردہ سوئیگاروز پروٹین A موتیوں کو 6 پر سینٹری فیوج کے ذریعے الگ کریں، 4 ڈگری پر 30 سیکنڈ کے لیے000 xg، سپرنٹنٹ کو ایسپریٹ کریں، اینٹی باڈی ورکنگ سلوشن یا نارمل IgG ورکنگ سلوشن کا 500 μL شامل کریں، دوبارہ بند کریں۔ اور پھر ٹرن اوور مکسر پر کمرے کے درجہ حرارت پر 15-60 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔

نوٹ: یہ بھی ممکن ہے کہ مرحلہ 3 میں تیار کردہ SweAgarose Protein A موتیوں کو براہ راست مناسب مقدار میں اینٹی باڈی یا عام IgG کے ساتھ انکیوبیٹ کریں۔

c) موتیوں کا الگ کرنا اور دھونا: انکیوبیٹڈ موتیوں کو سنٹری فیوج کے ذریعے 6،000 xg پر 30s کے لیے 4 ڈگری پر الگ کریں، سپرنٹنٹ کو ایسپیریٹ کریں، 1×TBS کا 500 μL شامل کریں، سویاگاروز پروٹین A موتیوں کو آہستہ سے پھونک کر دوبارہ بند کریں۔ ایک پائپیٹ، 6 پر سینٹری فیوج،000 4 ڈگری پر 30s کے لیے xg، سپرنٹنٹ کو ہٹا دیں، تین بار دھونے کو دہرائیں، اور موتیوں کو 1×TBS کے ساتھ اسی مقدار میں دوبارہ لگائیں جو ابتدائی والیوم میں ہے۔

نوٹ: اگر انکیوبیشن اور دھونے کے دوران موتیوں کی مالا جمع یا فلیکی ہو تو یہ ایک معمول کی بات ہے اور تجرباتی نتائج کو متاثر نہیں کرے گی۔

5. Immunoprecipitation (IP):

a) غیر مخصوص بائنڈنگ کو ہٹانا (اختیاری): مرحلہ 4 میں تیار کردہ SweAgarose پروٹین A موتیوں کو، جو عام IgG کو باندھتا ہے، نمونوں کے ساتھ 4 ڈگری پر 60 منٹ تک انکیوبیٹ کیا جاتا ہے اور 6،000 پر سینٹری فیوج کے ذریعے الگ کیا جاتا ہے۔ xg 30s کے لیے 4 ڈگری پر، اور سپرنٹنٹس کو بعد کے تجربات کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ اس قدم کا مقصد ان پروٹینوں کو ہٹانا ہے جو غیر خاص طور پر عام IgG سے منسلک ہوتے ہیں۔

b) SweAgarose Protein A موتیوں کے ساتھ نمونوں کا انکیوبیشن اینٹی باڈی یا نارمل IgG کے ساتھ کنجوگیٹڈ: SweAgarose Protein A موتیوں کو اینٹی باڈی یا نارمل IgG کے ساتھ 20 ul bead suspension کے تناسب سے شامل کریں، ہر 500 ul پروٹین کے نمونے کے لیے ایک طرف رکھیں۔ oscillating shaker یا روٹری مکسر، اور کمرے میں 2 گھنٹے تک انکیوبیٹ کریں۔ درجہ حرارت یا رات بھر 4ºC پر۔

نوٹ 1: اگر انکیوبیشن اور دھونے کے دوران موتیوں کی مالا جمع یا فلیکی ہو، تو یہ ایک عام واقعہ ہے اور تجرباتی نتائج کو متاثر نہیں کرے گا۔

نوٹ 2: متبادل طور پر، مناسب مقدار میں اینٹی باڈی یا نارمل IgG کو نمونے کے ساتھ کمرے کے درجہ حرارت پر 1-2 گھنٹے تک یا رات بھر 4 ڈگری پر انکیوبیٹ کیا جا سکتا ہے، اور پھر 10-20 μL ایگروز بیڈ سسپنشن شامل کیا جا سکتا ہے۔ اور کمرے کے درجہ حرارت پر 60 منٹ تک انکیوبیٹ کیا جاتا ہے۔

c) سینٹری فیوج: انکیوبیشن کے بعد، سپرنیٹینٹ کو ہٹانے کے لیے 6،000 xg پر 30s کے لیے 4 ڈگری پر سینٹری فیوج۔

نوٹ: امیونوپریسیپیٹیشن کے اثر کو جانچنے کے لیے سپرنٹنٹ کا ایک حصہ اپنے پاس رکھیں۔

d) دھوئیں: 1×TBS کا 500 ul شامل کریں، دوبارہ بند ہونے والی موتیوں کو پپیٹ کے ساتھ آہستہ سے اڑا دیں، 6 پر سینٹری فیوج،000 xg 30s کے لیے 4 ڈگری پر سپرنٹنٹ کو ہٹا دیں اور تین بار دھونے کو دہرائیں۔

نوٹ: آپ واشنگ بفر کے OD280 کی جانچ بھی کر سکتے ہیں تاکہ یہ معلوم کیا جا سکے کہ آیا واشنگ مکمل ہو گئی ہے، اگر OD280 0.05 سے زیادہ ہے، تو دھونے کے اوقات کی تعداد میں مناسب اضافہ کیا جانا چاہیے۔

6. ایلیوشن

ٹارگٹ پروٹین کی خصوصیات اور بعد کے تجربات کی ضروریات پر منحصر ہے، اخراج کے لیے درج ذیل طریقوں میں سے ایک کا انتخاب کیا جا سکتا ہے۔

a) خارج کرنے کا طریقہ: اس طریقہ کے ذریعے اخذ کیے گئے نمونے SDS-PAGE کے لیے موزوں ہیں۔ سینٹری فیوج کے بعد ٹیوب میں 25 µL 1× پروٹین سیمپلنگ بفر (کم کیا ہوا) شامل کریں، 95 ڈگری پر 5 منٹ تک گرم کریں، اور پھر مغربی دھبے کا پتہ لگانے کے لیے سپرناٹینٹ کو جمع کرنے کے لیے سینٹی فیوج کریں۔

ب) تیزابیت کا اخراج: اس طریقہ سے نکالا گیا نمونہ اپنی اصل حیاتیاتی سرگرمی کو برقرار رکھتا ہے اور اسے بعد از فنکشنل تجزیہ کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ سینٹری فیوج کے بعد ٹیوب میں 20 µL ایسڈ ایلیوشن بفر شامل کریں، اچھی طرح مکس کریں اور کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ تک انکیوبیٹ کریں، پھر ایک نئی EP ٹیوب میں سپرنٹنٹ کو جمع کرنے کے لیے سینٹری فیوج کریں، اور pH کو ایڈجسٹ کرنے کے لیے فوری طور پر 2 µL Neulization Elution Buffer شامل کریں۔ ایلوٹڈ پروڈکٹ کو نیوٹرل کرنے کے لیے، جسے بعد از فنکشنل تجزیہ کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔

نوٹ: صارف مطلوبہ حجم کے مطابق شامل کردہ ایلیوشن بفر کی مقدار کو ایڈجسٹ کر سکتا ہے۔

 

 

1. SweAgarose Protein A کو کٹ میں -20 ڈگری پر ذخیرہ نہ کریں یا بار بار منجمد اور پگھلائیں، ورنہ یہ مقناطیسی موتیوں کی کارکردگی کو متاثر کرے گا اور غیر ضروری تجرباتی غلطیوں کا سبب بنے گا۔

2. امیونوپریسیپیٹیشن کے طریقہ کار کو انجام دینے سے پہلے براہ کرم ان ہدایات کو غور سے پڑھیں۔

3. اگر مدافعتی ٹارگٹ پروٹین میں فاسفوریلیشن یا ایسٹیلیشن ترمیم شامل ہے تو مناسب فاسفیٹیس انحیبیٹرز اور ڈیسیٹیلیز انابیٹرز فراہم کیے جائیں۔

4. موتیوں کو pH 6-8 پر رکھیں، تیز رفتار سینٹرفیوگریشن، خشک ہونے یا جمنے سے گریز کریں، جو موتیوں کے جمع ہونے کا سبب بن سکتا ہے۔

5. استعمال کرنے سے پہلے موتیوں کو اچھی طرح سے ملایا جانا چاہئے، مکسنگ آپریشن نرم ہونا چاہئے اور اینٹی باڈی کی خرابی سے بچنے کے لئے پرتشدد گھومنے اور ہلنے کا نشانہ نہیں بننا چاہئے۔

6. امیونوپریسیپیٹیشن میں مثبت اور منفی کنٹرول (SweAgarose Mouse IgG) کی سفارش کی جاتی ہے۔

7. پروٹین کے نمونوں کو جمع کرنے کے بعد جلد از جلد صاف کیا جانا چاہیے اور پروٹین کی کمی یا انحطاط کو کم کرنے کے لیے ہمیشہ 4 ڈگری پر یا برف کے غسل میں رکھنا چاہیے۔

8. تیزاب کے اخراج کے ساتھ استعمال کرنے پر Agarose موتیوں کی مالا جمع ہو سکتی ہے، جو کہ ایک عام رجحان ہے اور مقناطیسی موتیوں کے عام استعمال کو متاثر نہیں کرتا ہے۔

9. یہ پروڈکٹ پیشہ ور افراد کے سائنسی تحقیقی استعمال تک محدود ہے، اور اسے طبی تشخیص یا علاج، خوراک یا دوا، یا کسی عام رہائش گاہ میں ذخیرہ کرنے کے لیے استعمال نہیں کیا جانا چاہیے۔

10. مناسب حفاظتی لباس پہنیں جیسے لیبارٹری کے اوورالز، حفاظتی شیشے اور دستانے۔

11. مختلف عام ذرائع اور ذیلی قسموں کے اینٹی باڈیز کے لیے پروٹین A اور پروٹین G کی پابند صلاحیت جدول I میں دکھائی گئی ہے۔

 

ٹیبل 1

پرجاتیوں	آئی جی	پروٹین اے	پروٹین جی	کل آئی جی	پروٹین اے	پروٹین جی
انسان	آئی جی جی 1	++++	++++	انسان	++++	++++
	آئی جی جی 2	++++	++++	ماؤس	+++	+++
	آئی جی جی 3	-	++++	چوہا	+/-	++
	آئی جی جی 4	++++	++++	خرگوش	++++	+++
	آئی جی اے	++	-	بکری	-	++
	آئی جی ڈی	++	-	چکن	-	+
	آئی جی ای	++	-	گائے	++	++++
	آئی جی ایم	++	-	گنی پگ	++++	++
ماؤس	آئی جی جی 1	+	++++	ہیمسٹر	+	++
	آئی جی جی 2 اے	++++	++++	گھوڑا	++	++++
	آئی جی جی 2 بی	+++	+++	سور	+++	+++
	آئی جی جی 3	++	+++	بھیڑ	+/-	++
	آئی جی ایم	+/-	-	++++: مضبوط بنگ
چوہا	آئی جی جی 1	-	+	++~+++: میڈیم بائنڈنگ
	آئی جی جی 2 اے	-	++++	+: کمزور بائنڈنگ
	آئی جی جی 2 بی	-	++	+/-: کمزور یا کوئی پابند نہیں۔
	IgG2c	+	++	-:کوئی بائنڈنگ نہیں۔
	آئی جی ایم	+/-	-

 

صرف تحقیق کے لیے استعمال کریں۔ تشخیصی یا علاج کے طریقہ کار میں استعمال کے لیے نہیں!

 

 

ڈاؤن لوڈ، اتارنا ٹیگ: immunoprecipitation kit (protein a agarose)، چائنا immunoprecipitation kit (protein a agarose) مینوفیکچررز، سپلائرز، فیکٹری