مقناطیسی پلانٹ آر این اے نکالنے کی کٹ

نیوکلک ایسڈ نکالنے اور صاف کرنے کے لیے خاص طور پر تیار کردہ سپر پیرا میگنیٹک مقناطیسی موتیوں اور خاص طور پر آپٹمائزڈ لیسز بفر سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے، یہ کٹ خاص طور پر پودوں کے بافتوں کے نمونوں کے آر این اے کو باندھ سکتی ہے اور نمونوں میں نیوکلک ایسڈ کے علاوہ دیگر نجاست کو دور کرسکتی ہے۔ کٹ کو فینول، کلوروفارم اور دیگر ری ایجنٹس کی ضرورت نہیں ہے۔ آپریشن آسان اور تیز ہے، ملٹی سٹیپ سینٹرفیوگریشن کی ضرورت نہیں۔ یہ کٹ 50-100 ملی گرام سادہ پودوں کے بافتوں کے نمونوں (جیسے گندم، مکئی کے پتے وغیرہ) سے اعلیٰ پاکیزگی اور اعلیٰ سالمیت والے RNA کو تیزی سے نکال سکتی ہے۔

DNase، DTT سلوشن کو گیلی برف میں منتقل کیا جاتا ہے اور -20 ڈگری پر ذخیرہ کیا جاتا ہے۔ باقی ری ایجنٹس کو کمرے کے درجہ حرارت پر منتقل اور محفوظ کیا جاتا ہے۔ میعاد ختم ہونے کی تاریخ 12 ماہ ہے۔

1. اگر بفر PRL1 تیز ہو جاتا ہے تو براہ کرم اسے 37 ڈگری پر گرم کریں اور کمرے کے درجہ حرارت پر بحال ہونے پر اسے استعمال کریں۔

2. استعمال کرنے سے پہلے، براہ کرم DTT سلوشن کو بفر PRL3 میں شامل کریں جب تک کہ حتمی ارتکاز 4% نہ ہو جائے، یعنی 1 mL بفر PRL3 میں 40 µL DTT سلوشن شامل کریں۔ یہ lysate بہترین تازہ تیار کیا جاتا ہے، DTT سلوشن میں شامل بفر PRL3 کو ایک ماہ کے لیے 4 ڈگری پر محفوظ کیا جا سکتا ہے۔

3. استعمال سے پہلے، براہ کرم Buffer RWA میں 24 mL مطلق ایتھنول اور Buffer RWB میں 96 mL مطلق ایتھنول شامل کریں۔

4. گرائنڈر کے ساتھ پیسنے کے وقت، چکی کو پہلے سے ٹھنڈا کریں۔

5. خود فراہم کردہ مقناطیسی فریم۔

1. پودوں کے ٹشوز کا لیسس:

{{0}} ملی گرام تازہ یا کریوپریزرڈ پلانٹ ٹشو کو 2.0 ملی لیٹر نیوکلیز فری پیسنے والی ٹیوب (تجویز کردہ HT-200-M) میں منتقل کریں جس میں 3-4 3 ملی میٹر زرکونیا موتیوں (تجویز کردہ G{{6) }}G) اور مائع نائٹروجن کے ساتھ پہلے سے ٹھنڈا کیا جاتا ہے۔ پیسنے والی ٹیوب کو گرائنڈر پر رکھیں (تجویز کردہ KZ-5F-3D) (پیسنے والی ٹیوب لگانے سے پہلے اڈاپٹر کو مائع نائٹروجن میں جلدی سے ٹھنڈا کریں۔ پیسنے کا تجویز کردہ طریقہ کار: فریکوئنسی کو 60 HZ، درجہ حرارت پر سیٹ کریں 4 ڈگری، ہر بار 30 سیکنڈ کے لیے پیس لیں، عمل کو 4 بار دہرائیں، ہر ایک کے درمیان 5 سیکنڈ کے وقفے کے ساتھ پیسیں) اور اس وقت تک پیسیں جب تک کہ یہ مکمل طور پر پاؤڈر نہ ہوجائے (اگر ٹشو مکمل طور پر پاؤڈر کے لیے گراؤنڈ نہیں ہوتا ہے، تو یہ آر این اے کی پیداوار اور معیار کو متاثر کرے گا۔ جب تک ٹشو مکمل طور پر گراؤنڈ نہ ہوجائے پیسنے کا وقت بڑھایا جاسکتا ہے)۔ پیسنے کا عمل مکمل ہونے کے بعد، پیسنے والی ٹیوب میں 500 μL بفر PRL1 شامل کریں، مواد کو الٹا مکس کریں اور 56 ڈگری پر 15 منٹ تک انکیوبیٹ کریں، ہر 5 منٹ پر الٹا مکس کریں۔

2. کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ کے لیے 12،000 rpm پر سینٹری فیوج، سپرنٹنٹ کو ایک نئی 1.5 ملی لیٹر سینٹری فیوج ٹیوب میں منتقل کریں۔ بفر PRL2 کا 1/5 سپرنٹنٹ والیوم شامل کریں، مکمل طور پر الٹا اور اچھی طرح مکس کریں۔

3. سینٹری فیوج 12،000 rpm پر 5 منٹ کے لیے 4 ڈگری پر، سپرنٹنٹ کو ایک نئی 20 mL سینٹری فیوج ٹیوب میں منتقل کریں۔ سپرنٹنٹ میں 500 μL بفر PRL3 شامل کریں (اس بات کو یقینی بنائیں کہ آپ نے استعمال سے پہلے DTT سلوشن شامل کیا ہے)، مکمل طور پر الٹا اور اچھی طرح مکس کریں۔

4. پچھلے مرحلے سے مرکب میں ایتھنول کا 2/3 حجم شامل کریں، مکمل طور پر الٹا اور اچھی طرح مکس کریں۔ پھر 30 μL SweMag Beads (SweMag Beads استعمال کرنے سے پہلے یکساں طور پر منتشر ہونا چاہئے) شامل کریں اور پائپیٹ یا vortex oscillation کے ساتھ اچھی طرح مکس کریں۔

5. کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ تک کھڑے رہیں، اور پلیسمنٹ کے عمل کے دوران، SweMag موتیوں کی معطلی کو برقرار رکھنے کے لیے SweMag موتیوں کو پپیٹ اڑانے یا vortex oscillation کا استعمال کرتے ہوئے متعدد بار ملایا گیا۔

6. سینٹری فیوج ٹیوب کو مقناطیسی فریم میں منتقل کریں اور اسے 30 سیکنڈ تک کھڑا رہنے دیں۔ جب سپرنیٹنٹ صاف ہو جائے تو اسپائریٹ کریں اور سپرنٹنٹ کو ضائع کریں۔

7. 600 μL بفر RWA شامل کریں، مقناطیسی فریم کو ہٹائیں، پھونکنے کے لیے ایک پپیٹ استعمال کریں یا بھنور کو ہلائیں جب تک کہ مقناطیسی موتیوں کو اچھی طرح سے منتشر نہ کر دیں۔ سینٹرفیوج ٹیوب کو مقناطیسی فریم میں منتقل کریں اور اسے 30 سیکنڈ تک کھڑا رہنے دیں۔ جب سپرنیٹنٹ صاف ہو جائے تو اسپائریٹ کریں اور سپرنٹنٹ کو ضائع کریں۔

8. 700 μL بفر RWB شامل کریں، مقناطیسی فریم کو ہٹائیں، پھونکنے یا بھنور کو ہلانے کے لیے پائپیٹ کا استعمال کریں جب تک کہ مقناطیسی موتیوں کو اچھی طرح سے منتشر نہ کر دیں۔ سینٹرفیوج ٹیوب کو مقناطیسی فریم میں منتقل کریں اور اسے 30 سیکنڈ تک کھڑا رہنے دیں۔ جب سپرنیٹنٹ صاف ہو جائے تو اسپائریٹ کریں اور سپرنٹنٹ کو ضائع کریں۔

9. مقناطیسی فریم کو ہٹا دیں، اور DNase عمل انہضام انجام دیں:

a) DNase رد عمل کے حل کی تیاری: 10 μL 10 × DNase Buffer، 10 μL DNase، 80 μL نیوکلیز سے پاک پانی کو ایک نئی 1.5 ملی لیٹر نیوکلیز فری سینٹرفیوج ٹیوب میں مکس کریں۔

b) مقناطیسی موتیوں پر مشتمل سینٹری فیوج ٹیوب میں 100 μL DNase رد عمل کا حل شامل کریں۔ پھونکنے یا بھنور کو ہلانے کے لیے پپیٹ کا استعمال کریں جب تک کہ مقناطیسی موتیوں کو اچھی طرح سے منتشر نہ کر دیا جائے۔ کمرے کے درجہ حرارت پر 15 منٹ پر کھڑے رہیں، اس دوران مقناطیسی موتیوں کو ہر 5 منٹ پر ایک پپیٹ کے ساتھ ملایا جاتا ہے۔

c) 600 μL بفر RWB شامل کریں، پھونکنے یا بھنور کو ہلانے کے لیے پائپیٹ کا استعمال کریں جب تک کہ مقناطیسی موتیوں کو اچھی طرح سے منتشر نہ کر دیا جائے۔ سینٹرفیوج ٹیوب کو مقناطیسی فریم میں منتقل کریں اور اسے 30 سیکنڈ تک کھڑا رہنے دیں۔ جب سپرنیٹنٹ صاف ہو جائے تو اسپائریٹ کریں اور سپرنٹنٹ کو ضائع کریں۔

10۔ مرحلہ 8 دہرائیں۔

11. سینٹری فیوج ٹیوب کی ٹوپی کو کھولیں اور کمرے کے درجہ حرارت پر 5-10 منٹ تک کھڑے رہیں، تاکہ باقی ماندہ ایتھانول مکمل طور پر بخارات بن سکے (مقناطیسی موتیوں کے زیادہ خشک ہونے سے بچیں، جو نیوکلک ایسڈ کی پیداوار کو متاثر کر سکتا ہے)۔

12. مقناطیسی فریم کو ہٹائیں، سینٹرفیوج ٹیوب میں 100-150 μL نیوکلیز فری پانی شامل کریں، پھونکنے کے لیے پائپیٹ کا استعمال کریں یا بھنور کو ہلائیں جب تک کہ مقناطیسی موتیوں کو اچھی طرح سے منتشر نہ کر دیا جائے۔ کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ کھڑے رہیں۔

13. سنٹری فیوج ٹیوب کو مقناطیسی فریم میں منتقل کریں جب تک کہ مقناطیسی موتیوں کو مکمل طور پر جذب نہ کر لیا جائے اور اعلی طہارت RNA حاصل کرنے کے لیے ایک نئی 1.5mL نیوکلیز فری سینٹرفیوج ٹیوب میں سپرنٹنٹ کو جذب نہ کر لیں۔

1. آپریشن سے پہلے اس پروڈکٹ کا دستی احتیاط سے پڑھیں۔

2. مقناطیسی مالا کو ذخیرہ کرنے کے دوران جمنے سے بچنا چاہیے۔ مقناطیسی مالا حل کرنا آسان ہے اور اسے یکساں معطلی کی حالت میں رکھنے کے لیے استعمال کرنے سے پہلے اسے پوری طرح ہلانا چاہیے۔

3. نمونے میں مقناطیسی موتیوں کو شامل کرنے سے پہلے، نمونے میں ری ایجنٹس کو اچھی طرح سے ملانے کی ضرورت ہے۔

4. ایتھنول کو آر این اے کو خارج کرنے سے پہلے مکمل طور پر اتار چڑھاؤ کا شکار ہونا چاہیے تاکہ نیچے کی طرف ہونے والے تجربات کو متاثر کرنے والے بقایا ایتھنول سے بچ سکیں۔

5. موتیوں کو زیادہ دیر تک خشک نہ کریں کیونکہ یہ آر این اے کے اخراج کی کارکردگی کو متاثر کر سکتا ہے۔

6. تجربے کے دوران لیب کوٹ، ڈسپوزایبل دستانے اور ماسک پہنیں، بات کرنے سے گریز کریں، اور کراس آلودگی سے بچنے کے لیے نیوکلیز فری ٹپس اور سینٹری فیوج ٹیوب کا استعمال کریں۔

اس کٹ کے ذریعہ مختلف قسم کے پودوں اور فنگس کے نمونوں سے حاصل کردہ آر این اے کی پیداوار کو نیچے دی گئی جدول میں دکھایا گیا ہے۔ آر این اے کی پیداوار کا تعلق پودوں کی انواع، اعضاء، تازگی اور نشوونما کی کیفیت سے ہے۔ مندرجہ ذیل جدول صرف حوالہ کے لیے ہے۔

صرف تحقیقی استعمال کے لیے!

ڈاؤن لوڈ، اتارنا ٹیگ: مقناطیسی پلانٹ آر این اے ایکسٹرکشن کٹ، چین میگنیٹک پلانٹ آر این اے ایکسٹرکشن کٹ مینوفیکچررز، سپلائرز، فیکٹری