کلک-iT EDU-488 سیل کے پھیلاؤ کا پتہ لگانے کی کٹ

 

پروڈکٹ کا نام	مصنوعات کی شناخت	ماڈل
کلک-iT EDU-488 سیل کے پھیلاؤ کا پتہ لگانے کی کٹ	G1601	100T

 

 

خلیوں کے پھیلاؤ کی صلاحیت کا تجزیہ زندگی سائنس میں ایک عام اور اہم تشخیصی طریقہ ہے۔ یہ وٹرو میں کلچرڈ سیلز پر بعض جینز، ادویات وغیرہ کے اثر و رسوخ کا فیصلہ کر سکتا ہے، یا مختلف حالات یا محرک کے تحت بافتوں کے خلیوں کی نشوونما اور تجدید کی صلاحیت کا تجزیہ کر سکتا ہے۔ فی الحال، سیل کے پھیلاؤ کا پتہ لگانے کے بہت سے طریقے ہیں۔ ان میں سے زیادہ تر سیل کے پھیلاؤ کی سرگرمی (جیسے CCK-8 طریقہ، MTT طریقہ، وغیرہ) کا بالواسطہ اندازہ لگانے کے لیے خلیات کے ذریعہ تیار کردہ کچھ میٹابولک انزائمز کا استعمال کرتے ہیں، لیکن کچھ دوائیں یا سیل کی حالت پر ایک خاص اثر پڑے گا۔ تشخیص کے نتائج. خلیات کے پھیلاؤ کا تعین کرنے کے لیے خلیات میں ڈی این اے کی ترکیب کا براہ راست پتہ لگانے کو سب سے درست اور موثر طریقہ کار کے طور پر تسلیم کیا جاتا ہے۔ تاہم، اصل ریڈیو لیبل والے نیوکلیوسائیڈ کو شامل کرنے کا طریقہ اور اینٹی باڈی کا پتہ لگانے پر مبنی BrdU طریقہ کار کی بعد میں بہتری دونوں کی اپنی اپنی حدود ہیں۔

EDU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine، 5-ethynyl-2'-deoxyuridine) ایک thymidine analogue ہے جس میں ایک acetylene گروپ ہوتا ہے، جب جانوروں میں انجکشن لگایا جاتا ہے یا انکیوبٹنگ سیلز میں کلچر کیا جاتا ہے۔ وٹرو، یہ چھوٹے مالیکیول تیزی سے مختلف اعضاء اور بافتوں میں پھیل سکتے ہیں، اور اندر گھس سکتے ہیں۔ خلیات، اور سیل کے پھیلاؤ کے دوران thymidine (T) کو نئے ترکیب شدہ DNA میں تبدیل کر سکتے ہیں۔ ای ڈی یو مالیکیول میں ایسٹیلین گروپ فلوروسینٹلی آئی ایف 488 لیبل والے ایزائڈ کمپاؤنڈ پروب کے ساتھ رد عمل ظاہر کر کے تانبے کے آئنوں کے کیٹالیسس کے تحت ایک مستحکم ٹرائیازول رنگ بنا سکتا ہے، اس لیے نئے ترکیب شدہ ڈی این اے کو متعلقہ فلوروسینٹ پروب کے ساتھ لیبل لگایا جا سکتا ہے۔ ریڈیو لیبل والے نیوکلیوسائیڈ کارپوریشن کے طریقہ کار کے مقابلے میں، EDU کا پتہ لگانے کے طریقہ کار میں کوئی محدود عوامل نہیں ہیں جیسے تابکار آلودگی؛ BrdU پتہ لگانے کے طریقہ کار کے مقابلے میں، EDU کا پتہ لگانے کے طریقہ کار کو DNA ڈینیچریشن یا اینٹیجن اینٹی باڈی ردعمل کی ضرورت نہیں ہے، جو تجربے کی پیچیدگی کو بہت حد تک کم کر دیتا ہے اور تجربے کو زیادہ وقت بچانے والا، زیادہ حساس، زیادہ مستحکم اور زیادہ درست بناتا ہے۔

اس کٹ کو مہذب خلیوں یا جانوروں کے بافتوں میں خلیوں کے پھیلاؤ کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ اس کٹ میں فلوروسینٹ پروب گرین فلوروسینس ہے، زیادہ سے زیادہ اتیجیت طول موج 491 nm ہے، اور زیادہ سے زیادہ اخراج طول موج 516 nm ہے۔ پھیلنے والے خلیوں پر لیبل لگانے کے بعد، سیل نیوکلئس چمکدار سبز فلوروسینس دکھائے گا، اور سیل نیوکلئس کو ملاپ والے روایتی نیوکلیئر ڈائی کے ساتھ مشترکہ طور پر لیبل لگایا جائے گا (یہ کٹ Hoechst 33342 سیل نیوکلیئر ڈائی فراہم کرتی ہے)، آپ فلوروسینس مائکروسکوپ، لیزر کنفوکل مائکروسکوپ استعمال کر سکتے ہیں۔ سیل کے پھیلاؤ کا براہ راست مشاہدہ کرنے کے لیے اور دیگر آلات؛ آپ وٹرو میں کلچرڈ سیلز کی فلوروسینس کی شدت کا پتہ لگانے کے لیے فلو سائٹومیٹری کا بھی استعمال کر سکتے ہیں، اور پھر وسط S مرحلے میں فلوروسینس کی شدت DNA ریپلیکشن سرگرمی کی بنیاد پر سیل سائیکل کا تعین کر سکتے ہیں۔

 

 

ریجنٹ B(iF488 ڈائی) کو روشنی سے دور -20 ڈگری پر اسٹور کیا جانا چاہیے۔

EDU کیٹلیٹک ریجنٹ (Reagent A) اور ری ایکشن بفر کو 4 ڈگری پر ذخیرہ کیا جا سکتا ہے۔

12 ماہ کے لیے درست۔

 

 

اجزاء نمبر	جزو	G1601-100T
G1601-1	ای ڈی یو اسٹوریج حل (10 ایم ایم)	100 μL
G1601-2	ریجنٹ اے	120 μL
G1601-3	ریجنٹ بی (iF488 ڈائی)	50 μL
G1601-4	ریجنٹ سی	2 × 100 ملی گرام (پاؤڈر)
G1601-5	ردعمل بفر	20 ملی لیٹر
G1601-6	Hoechst 33342 سٹیننگ سلوشن	30 μL
دستی		1 پی سی

نوٹ: اوپر رد عمل کے اوقات متعلقہ 96-وییل پلیٹ پرکھ کے لیے ہیں۔

 

 

1. سیل کلچر میڈیم جس میں سیرم ہے۔

2. پارمیبلائزیشن حل: 0۔{2}}.5% Triton X-100 PBS میں

3. درست حل: PBS میں 4% paraformaldehyde، pH 7.4 (ہماری پروڈکٹ تجویز کریں،Cat.#:G1101)؛

4. PBS بفر (ہماری پروڈکٹ کی تجویز کریں، بلی. #:G4202)؛

5. انتہائی صاف پانی؛

6. جانوروں کی ماڈلنگ اور ٹشو سیکشننگ سے متعلق ری ایجنٹس (جانوروں کے ٹشو سیل کے پھیلاؤ پرکھ)۔

 

 

1. وٹرو میں مہذب خلیوں کا پہلے سے علاج:

1.1 خلیات کو ایک خاص کثافت پر سیل کلچر پلیٹ میں یکساں طور پر لگائیں (پودے لگانے کی کثافت کا تعین سیل کے سائز، ترقی کی رفتار وغیرہ جیسے عوامل سے ہوتا ہے)۔ جب خلیات دیوار سے چپک جاتے ہیں یا معمول کی حالت میں واپس آجاتے ہیں تو اسی طرح کی دوائیوں کی حوصلہ افزائی اور دیگر علاج انجام دیں۔ (معطلی خلیوں کے لیے، براہ کرم معطلی کے خلیات کے عام آپریشن کے طریقہ کار پر عمل کریں۔ پورے تجربے میں سینٹرفیوگریشن اور دیگر مراحل شامل کرنے کی ضرورت ہے)۔

1.2 کیٹلیٹک ایڈیٹیو (ریجنٹ سی) کو کم رفتار سے سینٹرفیوج کیا گیا، 100 ملی گرام لیا گیا اور 1 ملی لیٹر الٹرا پیور پانی ڈال کر تحلیل کیا گیا اور اسے -20 ڈگری پر تقسیم اور ذخیرہ کیا گیا، باقی پاؤڈر کو ریزرو کے طور پر رکھا گیا۔

 

2. ان وٹرو سیلولر EDU لیبلنگ، فکسیشن اور پارمیبلائزیشن:

2.1 2×EdU انکیوبیشن ورکنگ سلوشن تیار کریں: مکمل سیل کلچر میڈیم کے ہر 1 ملی لیٹر میں 2 μL EDU سٹوریج سلوشن (10 mM) شامل کریں، جو 20 μM 2×EdU انکیوبیشن ورکنگ سلوشن ہے، اور اسے انکیوبیٹر میں پہلے سے گرم کرنے کے لیے ڈالیں ( تجویز کردہ ابتدائی تجربات کے لیے EDU کام کرنے کا ارتکاز 10 μM ہے؛

2.2 آدھے بدلنے والے موڈ میں، کلچر پلیٹ میں اصل سیل کلچر میڈیم کا آدھا حصہ اسپائریٹ کریں، اور پہلے سے گرم 2×EdU انکیوبیشن ورکنگ سلوشن کا مساوی حجم شامل کریں، اور ایک خاص مدت تک انکیوبیشن کریں (انکیوبیشن کی مدت عام طور پر منحصر ہوتی ہے۔ متعلقہ خلیات کی ترقی کے سائیکل پر، جو عام طور پر سیل سائیکل کا تقریباً 10 فیصد بنتا ہے۔ تیزی سے بڑھنے والے خلیات، تقریباً 2 گھنٹے تک انکیوبیشن کی سفارش کی جاتی ہے، مخصوص معاملات کے لیے اسے سیل کی خصوصیات، علاج کے بعد کی اصل صورت حال وغیرہ کے ساتھ ایڈجسٹ کرنے کی ضرورت ہے۔ کم وقت کے لئے، EDU حراستی کو مناسب طریقے سے بڑھایا جا سکتا ہے؛

2.3۔ ای ڈی یو انکیوبیشن کے بعد، پی بی ایس بفر سے 1-2 بار دھوئیں، خلیات کو ڈھانپنے کے لیے فکسنگ فلوئڈ ڈالیں، اور کمرے کے درجہ حرارت پر 15 منٹ کے لیے ٹھیک کریں (اگر فلو سائٹومیٹری کی ضرورت ہو، تو اس قدم سے پہلے ایڈرینٹ سیلز کو ہضم کر کے دوبارہ معطل کر دیا جانا چاہیے۔ ٹھیک کریں، معطلی سیل پروسیسنگ کے طریقہ کار پر عمل کریں) پی بی ایس بفر سے 2-3 بار دھوئیں، ہر بار 3-5 منٹ؛

2.4 PBS بفر کو ہٹا دیں، خلیات کو ڈھانپنے کے لیے پارمیبلائزیشن سلوشن شامل کریں، اور کمرے کے درجہ حرارت پر 15 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔

2.5 پارمیبلائزیشن سلوشن کو ہٹا دیں، PBS بفر سے 1-2 بار دھوئیں، ہر بار 3-5 منٹ۔ پھر مرحلہ 4 پر جائیں۔

 

3. جانور EDU انجیکشن ماڈلنگ کے ساتھ ساتھ ٹشو سیکشن پروسیسنگ:

3.1 تجرباتی تقاضوں کے مطابق، ایک یا ایک سے زیادہ EDU انجیکشن جانوروں کی ماڈلنگ کے لیے انٹراپریٹونیل انجیکشن، انٹرا مسکیولر انجیکشن، subcutaneous انجیکشن، ٹیل ویین انجیکشن وغیرہ کے ذریعے استعمال کیے جاتے ہیں۔ عام طور پر، EDU خوراک کا جانوروں کے جسمانی وزن میں تناسب 5 mg/kg ہے، اصل انجیکشن کی خوراک تحقیقی مواد اور جانوروں کی حالت پر منحصر ہے۔ اس کٹ میں فراہم کردہ EDU اسٹوریج سلوشن بنیادی طور پر وٹرو سیل EDU لیبلنگ کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ اگر آپ کو EDU کے ساتھ کسی جانور کا نمونہ بنانے کی ضرورت ہے، تو آپ EDU ریجنٹ کو الگ سے آرڈر کر سکتے ہیں (Cat. No.: G5059)؛

3.2 اپیٹیلیل خلیات جیسے چھوٹی آنت تیزی سے پھیلتے ہیں، جبکہ دماغی خلیے آہستہ آہستہ پھیلتے ہیں۔ تیزی سے بڑھنے والے ٹشوز کو عام طور پر لیبل لگانے میں 12 گھنٹے سے بھی کم وقت لگتا ہے، جب کہ وہ آہستہ بڑھنے والے ٹشوز کو لیبل لگانے میں کئی دن لگ سکتے ہیں۔ لیبل لگانے کے بہترین وقت کا تعین مخصوص تجربے کے مطابق کیا گیا تھا۔ آنتوں کے اپکلا ٹشو کے تیزی سے پھیلاؤ کی وجہ سے، اس طرح کے ٹشو کو لیبلنگ کے حوالے کے طور پر تجویز کیا گیا تھا۔

3.3 مخصوص معیار کے مطابق جانور کو مارنے کے بعد، ضروری ٹشوز نکالے جاتے ہیں اور روایتی طریقہ کار کے مطابق منجمد حصے یا پیرافین کے حصے بنائے جاتے ہیں:

a منجمد حصوں کے لیے: حصوں کو کمرے کے درجہ حرارت پر واپس کریں، مناسب مقدار میں فکسنگ فلوئڈ شامل کریں، اور کمرے کے درجہ حرارت پر 15 منٹ تک ٹھیک کریں۔ فکسنگ فلوئڈ کو ہٹائیں اور PBS بفر سے 3 بار ہر ایک کو 3-5 منٹ تک دھوئیں؛ پی بی ایس بفر کو ہٹا دیں اور ٹشو کو مناسب مقدار میں پارمیبلائزیشن سلوشن سے ڈھانپیں اور کمرے کے درجہ حرارت پر 10-15 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔ پارمیبلائزیشن سلوشن کو ہٹا دیں اور PBS بفر سے 1- 2 بار، 3-5 منٹ ہر بار دھو لیں۔ پھر مرحلہ 4 پر جائیں۔

ب پیرافین سیکشنز کے لیے: سیکشنز کو ڈیپرافینائز اور ری ہائیڈریٹ کریں، اور پی بی ایس سے 5 منٹ تک دھو لیں۔ PBS بفر کو ہٹا دیں، خلیات یا ٹشوز کو ڈھانپنے کے لیے پارمیبلائزیشن سلوشن شامل کریں، اور کمرے کے درجہ حرارت پر 15 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔ پھر پی بی ایس بفر سے 1-2 بار دھوئیں، ہر بار 3-5 منٹ تک۔ پھر مرحلہ 4 پر جائیں۔

 

4. EDU کلک ردعمل:

4.1 سیل یا ٹشو فکسیشن اور پرفوریشن کے دوران، رد عمل کے حل کی تیاری: ری ایجنٹس کو درج ذیل تناسب کے مطابق مکس کریں، تیاری کا حجم نمونوں کی تعداد کے تناسب سے بڑھا یا کم کیا جا سکتا ہے۔

 

جزو	حجم (سیل کے لیے)	حجم (ہسٹولوجیکل سیکشن کے لیے)
ردعمل بفر	935 μL	928 μL
ریجنٹ اے	10 μL	10 μL
ریجنٹ بی (iF488 ڈائی)	5 μL	12 μL
ریجنٹ سی	50 μL	50 μL
کل صلاحیت	1000 μL	1000 μL

 

4.2 خلیات یا حصوں سے پی بی ایس بفر کو ہٹا دیں، رد عمل کا محلول شامل کریں، اس بات کو یقینی بنانے کے لیے آہستہ سے ہلائیں کہ رد عمل کا محلول تمام خلیات یا بافتوں کو ڈھانپ لے، اور اندھیرے میں کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔

4.3 رد عمل کے محلول کو ہٹا دیں، PBS بفر سے 2-3 بار دھوئیں، ہر بار 3-5 منٹ (اگر کوئی اور خاص ضرورت نہیں ہے تو، فلوروسینس کی شدت کو فلو سائٹومیٹری کے ذریعے معلوم کیا جا سکتا ہے یا فلوروسینس اثر کا پتہ لگایا جا سکتا ہے دوسرے آلات)۔

 

5. جوہری داغ (اختیاری):

5.1 ہوچسٹ 33342 سٹیننگ سلوشن کو PBS بفر کے ساتھ 1:500-1000 کے تناسب سے پتلا کریں، سیل کو ڈھانپنے کے لیے نمونے میں شامل کریں، اور 5 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔

5.2 Hoechst 33342 سٹیننگ سلوشن کو ہٹا دیں، PBS بفر سے 2-3 بار دھوئیں، ہر بار 3-5 منٹ۔

6. امیجنگ اور پتہ لگانے کا تجزیہ:

پروسیس شدہ خلیوں یا ٹشو سیکشن کے نمونوں کا پتہ لگانے کے لیے فلوروسینس مائکروسکوپ یا کنفوکل مائکروسکوپ کا استعمال کریں، اور پھیلنے والے خلیوں کے تناسب کا تجزیہ کریں۔ متبادل طور پر، وٹرو میں کلچرڈ سیلز کو اکٹھا کیا جا سکتا ہے اور فلوروسینس کی شدت کو فلو سائٹومیٹری کے ذریعے ماپا جا سکتا ہے (یہ سفارش کی جاتی ہے کہ سیل کے نمونے استعمال کیے جائیں جن پر ای ڈی یو کا لیبل نہ لگے فلو سائٹومیٹری پرکھ کے لیے منفی کنٹرول کے طور پر اور مناسب وولٹیج کا انتخاب کریں)، اور اس کی بنیاد پر۔ فلوروسینس کی شدت پر، سیل سائیکل میں ایس فیز کی ڈی این اے نقل کی سرگرمی ہو سکتی ہے طے شدہ اس کٹ میں فلوروسینٹ ڈائی iF488 (Reagent B) Ex/Em: 491 nm/516 nm (سبز); Hoechst 33342 سٹیننگ سلوشن Ex/Em: 346 nm/460 nm (نیلا) کی سپیکٹرل خصوصیات سے مطابقت رکھتا ہے۔

 

 

1. مہذب خلیوں کے لیے، نمونے اور تحقیق کے مقصد کے لحاظ سے مخصوص EDU ارتکاز اور انکیوبیشن کے وقت کو مناسب طریقے سے ایڈجسٹ کیا جا سکتا ہے۔

2. بعض بافتوں کے خلیے آہستہ آہستہ پھیلتے ہیں۔ خراب ماڈلنگ اثر سے بچنے کے لیے، یہ سفارش کی جاتی ہے کہ تیزی سے پھیلاؤ والے ٹشو کے نمونے بطور حوالہ نمونے (جیسے آنتوں کے بافتوں) کو منتخب کریں۔

3. اگر پس منظر کا رنگ بہت گہرا ہے، تو یہ تجربے میں ناکافی دھونے، طویل عرصے سے طے شدہ، اور بقایا فکسٹیو وغیرہ کی وجہ سے ہو سکتا ہے۔

4. ریجنٹ سی (ای ڈی یو کیٹلیٹک اضافی ری ایجنٹ) آکسائڈائز کرنا آسان ہے۔ ہوا کی طویل نمائش سے بچنے کی کوشش کریں۔ ایک آبی محلول کے طور پر تیار ہونے کے بعد، اسے aliquot میں ذخیرہ کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔ تجربہ کیا، جیسے EDU اتپریرک additive ریجنٹ رنگ تھوڑا سا تبدیل ہوتا ہے، کلک رد عمل کیٹلیٹک نظام اب بھی عام طور پر آگے بڑھنے کے قابل ہے۔ اگر ریجنٹ C بھورا دکھائی دیتا ہے، تو یہ اشارہ کرتا ہے کہ جزو کی میعاد ختم ہو گئی ہے، لہذا براہ کرم اسے ضائع کر دیں۔

5. اپنی صحت اور حفاظت کے لیے، براہ کرم آپریشن کے دوران لیب کوٹ اور دستانے پہنیں۔

 

صرف تحقیقی استعمال کے لیے!

 

 

ڈاؤن لوڈ، اتارنا ٹیگ: Click-it edu-488 سیل کے پھیلاؤ کا پتہ لگانے والی کٹ، چائنا Click-it edu-488 سیل کے پھیلاؤ کا پتہ لگانے والے کٹ مینوفیکچررز، سپلائرز، فیکٹری